在进行PCR尤其是qPCR扩增时,微量外源DNA及气溶胶污染都可导致结果的假阳性。基于此种情况,各种防污染方法应运而生。紫外线(UV)照射虽可解决长链核酸污染,但其对小片段(<250bp)显效甚微。光化学法诱导4'-AMDMIP虽对核酸链的长短没有要求,但其与扩增产物的嘧啶碱基发生缩合反应仍存在效率问题,就目前看来UDG酶是较为理想的解决方案。
卫生部曾明确规定,凡是用于临床检验的PCR试剂,都应该有UDG酶技术,以防止污染。PCR防污染正是利用了UDG在DNA修复过程中的生物学特性,其不能作用于游离的尿嘧啶核苷、RNA 和四种正常的核苷酸等,但能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶。
UDG酶全称为尿嘧啶DNA糖基化酶,也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG酶。UDG酶能特异地识别DNA分子中出现的鸟嘧啶核苷,并将其切割下来,形成自由的尿嘧啶,在DNA除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的无碱基“空洞”,即脱嘌呤嘧啶位点,在加热或碱性条件下,DNA 在“ 糖一磷酸骨架”处断裂。
预防PCR非特异性扩增和污染常用的措施是使用UDG酶+dUTP的防污染体系,即以dUTP代替dTTP,在PCR体系中加入UDG酶。
PCR开始前,UDG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解,消除由污染DNA产生的扩增。在预变性阶段UDG酶被灭活,不会再降解目的产物U-DNA。在此方法下合成“U-DNA” 双链不是严格意义的DNA,无法进行下游的克隆实验,但可以应用于荧光定量PCR检测基因表达量。
UDG酶最早在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中被发现,但大肠杆菌来源的UDG酶较为耐热,经95℃10min处理仍残留尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性,可导致含有dU碱基的PCR产物降解。除了常规UDG外,热敏型UDG也被开发出来,优基生物推出的热敏型UDG酶是经大肠杆菌菌株中重组表达月光鱼UDG酶的突变体产生,在室温下即可发挥作用,55℃ 10min可完全失活。不同于其他商业化的耐热UDG,U&G UDG是一种不可逆的热灭活UDG。完全适用于one-step RT-PCR反应,且可以对PCR产物进行后续的各种分析测试(例如PCR产物的电泳、测序)。
产品特性
可完全且不可逆的热失活;
热失活时无需添加其它组分或抑制剂;
可以用于去除PCR或RT-PCR中的carry-over contamination;
处理后的PCR产物可以用于下游实验,如克隆及测序;
活性
UDG在25~37°C范围内都有较高的活性。
比活性
> 500,000 U/mg
使用常见的RT温度55°C对不同公司的UDG酶进行不同时间加热,比较残留的UDG活性。
结果显示,U&G UDG 在55°C加热10min可完全失活,完全适用于one-step RT-PCR反应。
产品性能-高效去除dU污染
分别使用含有dU和不含dU的模板DNA(107 copies),并在PCR体系中选择添加1个单位的U&G UDG,检测U&G UDG对PCR产物的降解效果。
结果显示,U&G UDG可快速降解含U的模板污染,且不影响不含U模板的扩增,可以有效保证实验结果的准确度。
产品性能-不可逆性
使用尿嘧啶(10mM ACG,20mM U)和 1 个单位的 5 种不同的市售UDG进行 PCR 。然后将 PCR 产物在室温下孵育 0 小时、1 小时、3 小时、6 小时和 24 小时。PCR 产物 95°C 加热 10 分钟,冷却,然后在琼脂糖凝胶上分析,评估 DNA 降解的程度。
PCR反应预处理:
(A)1 U U&G UDG (U&G Bio),
(B) E.coli UNG (New England Biolabs),
(C) BMTU UDG (Roche),
(D) HK-UDG (Epicentre) ,
(E) AmpErase (Applied Biosystems).
琼脂糖凝胶电泳结果表明:U&G UDG 是一种不可逆的热灭活UDG。